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CRISPR/Cas9基因编辑技术在癌症基础研究、诊断和治疗中的应用
2021-11-29
2020 年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna,因为他们开发了CRISPR/Cas9 基因编辑技术。
 
近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术发展的十分迅速,并且应用范围十分广泛。癌症是由肿瘤细胞的基因组变化引起的,CRISPR/Cas9可用于癌症研究领域,通过对癌症基因组进行编辑,探索肿瘤发生发展的机制。CRISPR/Cas9系统在癌症研究和治疗中得到越来越多的应用,并取得了显著的成果。本文主要介绍了基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统的机制和发展,并对该技术在肿瘤基础研究、诊断和治疗中的应用现状进行了综述。 
                                         
图片来源:https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6
 
CRISPR/Cas系统具有设计简单、实施迅速、成本低、可扩展性强等优点,研究者认为它是一个革命性的基因编辑工具箱,已扩展到几乎所有基因组目标。特别是,该系统已广泛应用于癌症研究,并已成为一种潜在的癌症诊断和治疗方法。
研究表明,癌症是一种潜在的致命疾病,它积累了多个基因,并改变了整个基因组的表观遗传学。在过去的二十年中,高通量测序技术鉴定了大量与癌症发生和发展相关的基因。基于这些进展,基因编辑技术有望通过调节基因表达和纠正基因突变来治疗癌症。
1. CRISPR/Cas9 基因编辑工具的机制
CRISPR/Cas9系统是一种可遗传的原核生物适应性抗病毒免疫系统。它包含两个主要组成部分,一个Cas9内切酶,还有一个单链引导RNA (sgRNA)。sgRNA引导Cas9内切酶以序列特异性的方式切割目标基因的两条DNA链。DNA裂解发生在“NGG”原间隔邻近基序(PAM)上游的序列3’碱基对上。在切割后,基因组DNA通过双链断裂(DSB)修复机制修复。因此,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过相对容易出错的非同源端连接(NHEJ)或高保真同源定向修复(HDR)引入小的插入或删除(indels)来实现基因组编辑[1]。
 

 
CRISPR/Cas9基因编辑系统的机制
图片来源:https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6

2. CRISPR/Cas9 基因编辑工具的发展历程
“CRISPR”重复序列于1987年被报道,2002年被命名。2012年体外实验证明成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对形成特殊的双链RNA结构,从而指导Cas9蛋白在目标 DNA 上引起双链断裂。2013年,Ⅱ型Cas系统应用于哺乳动物细胞DNA的切割,为CRISPR/Cas9系统应用于基因编辑铺平了道路。此后,CRISPR/Cas9 技术发展迅速,到 2020 年产生了几种基于 CRISPR/Cas9 的工具用于 DNA 和 RNA 水平的基因编辑。
 
图片来源:https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6

3. CRISPR/ cas9基因编辑工具在癌症基础研究中的应用
主要包含四个方面:
一:利用CRISPR/ cas9介导的敲除或敲入对功能基因进行鉴定和验证,包括癌基因、抑癌基因、化疗耐药基因、代谢相关基因和肿瘤干细胞相关基因。
二:利用CRISPR/Cas9文库筛选药物靶基因和功能基因。
三:CRISPR/Cas13系统在靶向并操作RNA中的应用。
四:利用体内生物素化的dCas9蛋白与gRNA可以进行相互作用研究,dCas9蛋白可与GFP等荧光标记物融合进行成像分析[2]。
 
图片来源:https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6
 
4. CRISPR/Cas9在癌症诊断中的应用
癌症的早期发现和治疗可以降低死亡率。基于CRISPR的诊断系统SHERLOCK和DETECTR可以用于检测癌症,SHERLOCK(特异性高灵敏度酶报告解锁)系统由RNA引导的RNase Cas13a(诱导非特异性单链DNA (ssDNA)反式切割)和RNA报告分子(RNA切割后释放)组成,在哺乳动物细胞中检测BRAF V600E和EGFR L858R的突变具有很高的敏感性[3]。另一个类似的系统名为DETECTR (DNA内切酶靶向CRISPR trans报告基因),由Cas12a和重组酶聚合酶扩增(RPA)组成,用于筛查癌症中的病毒感染和放大微样本。该系统可以快速、廉价地检测感染多种不同类型HPV的样本中的高危HPV类型[4]。
 
图片来源:10.1128/JCM.00745-20
 
5. CRISPR/Cas9基因编辑工具在癌症治疗中的应用
利用CRISPR/Cas9在体外编辑免疫细胞,将CAR基因定向插入到特定的位置。它是一种精确的方法,可以长期杀死癌细胞,更安全,提高T细胞的有效性,然后将这些细胞注射给患者以对抗癌症。Cyranoski等人进行了首个CRISPR人体试验,用CRISPR编辑的T细胞(敲除PD-1基因)治疗对化疗、放疗和其他治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者,最近发表了一项最新的试验结果(NCT02793856),证明了CRISPR基因编辑T细胞靶向PD-1的安全性和可行性[5]。还可以利用Cas9通过病毒基因组特异性Cas9-sgRNA消除致癌病毒。除此以外,利用CRISPR/Cas9基因编辑工具建立多基因突变的体内肿瘤模型,通过模拟人类癌症(异种移植),既可用于基础肿瘤学研究,从功能上推断癌症基因,也可用于抗癌药物筛选[6]。快速精确的CRISPR/Cas9技术使研究人员能够通过特定的基因修饰创建癌症小鼠模型,从而对多步骤致癌过程进行更客观的研究。
 
图片来源:https://doi.org/10.1186/s12943-021-01431-6
 
在短短几年时间里,CRISPR/Cas9作为一种稳定、高效、简单、广泛应用的基因编辑技术迅速出现并发展起来。CRISPR/Cas9已经从根本上影响了许多领域,如农业、生物技术和生物医学,但没有哪个领域比癌症研究受到的影响更深远。CRISPR/Cas9为肿瘤发生和发展机制的发现提供了更开阔的前景,更重要的是,CRISPR/cas9基因编辑技术为癌症治疗带来了巨大的希望。在该技术能够安全有效地应用于癌症的临床治疗之前,仍存在一些挑战。
 
 
参阅文献
[1] Zhang H, Qin C, An C, Zheng X, Wen S, Chen W, Liu X, Lv Z, Yang P, Xu W, Gao W, Wu Y. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer. 2021 Oct 1;20(1):126.
[2] Zhou Y ,  Ping W ,  Feng T , et al. Painting a specific chromosome with CRISPR/Cas9 for live-cell imaging[J]. Cell Research, 2017, 27(2).
[3] Gootenberg J S ,  Abudayyeh O O ,  Lee J W , et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science, 2017, 356(6336):438-442.
[4] Chen J S ,  Ma E ,  Harrington L B , et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science, 2018, 360(6387):eaar6245.
[5] Cyranoski D . Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial[J]. Nature, 2016, 535(7613):476-477.
[6] Cyranoski D . CRISPR gene-editing tested in a person for the first time[J]. Nature, 2016, 539(7630):479.
[7] Lu Y ,  Xue J ,  Deng T , et al. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer[J]. Nature medicine, 2020, 26(5):1-9.
[8]Ting-Hin, Chen, Honglin, et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein Barr virus in human cells[J]. The Journal of General Virology: A Federation of European Miorobiological Societies Journal, 2015, 96(Pt.3):626-636.
[9] Day C P ,  Merlino G ,  Van?Dyke T . Preclinical Mouse Cancer Models: A Maze of Opportunities and Challenges[J]. Cell, 2015, 163(1):39-53.
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