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大规模AAV的生产:Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统
2021-12-17
目前传统的AAV的生产方式是通过质粒转染细胞进而生产重组AAV,由于机制和成本上的限制,已经不能满足临床试验和注射大型动物所需要的高剂量要求。生产重组AAV有多种方式,目前应用的有质粒共转、Ad-AAV、HSV-AAV、Bac-AAV等生产系统。使用腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)作为辅助病毒包装AAV,由于辅助病毒能够感染宿主,因此不适合用于临床试验。为了实现更大规模的、更安全的AAV生产,采用昆虫细胞表达系统来包装AAV是更好的选择。结合Sf9细胞可以大量表达重组蛋白的特点,使用含有rAAV 基因组以及rAAV Rep/Cap基因的昆虫杆状病毒转导Sf9细胞,让AAV在Sf9细胞中组装,最终达到大规模生产AAV的目的。已经上市的基因治疗药物Glybera,便是采用的Bac-AAV系统生产的。接下来,为大家介绍Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统生产腺相关病毒的原理及流程。
 
Bac-to-Bac昆虫杆状病毒
 
表达系统组成部分
 
pFastBac载体:包含杆状病毒特异的启动子,在其下游插入病毒衣壳和复制蛋白基因后形成一个完整的表达元件。这个表达元件届时会以转座子的形式插入到穿梭质粒上。以pFastBacTMDual载体为例,该载体包含 Pp10和 PPH两个杆状病毒启动子,启动子后面的多克隆位点可以分别插入目的基因构建重组pFBD 载体,从而在构建的重组 pFBD 载体中形成两个表达框,表达框的外侧含有庆大霉素抗性基因(Genr)及转座子 Tn7 的左右两个臂,形成一个 mini-Tn7元件。
 
 
图片来源:http://www.honorgene.com/product_list/carrier_library/123178.html
 
Tn7转座子:因为涉及到转座重组,所以介绍一下这个系统用到的Tn7转座子。Tn7转座子是大肠杆菌中的一种位点特异性的转座子。Tn7转座子结构如下:
 
 
图片来源:Unbiased profiling of CRISPR RNA-guided transposition products by long-read sequencing.(Phuc Leo H. Vo,et al.  Mobile DNA, 2021).
 
Tn7转座子必须的元件:Tn7-L: 约150bp;Tn7-R: 约90bp。
 
任何片段只要带上了Tn7-L和Tn7-R这两个元件,就可以在Tn7转座蛋白的辅助下完成转座过程。Tn7-L与Tn7-R序列不同,它们决定了转座子插入的方向。Tn7的每个末端都含有约22bp的转座酶结合位点。
 
Tn7转座蛋白:Tn7编码5个转座蛋白,分别是TnsA, TnsB, TnsC, TnsD, TnsE。其中TnsA和TnsB形成转座酶,特异性识别转座子的末端,并将Tn7从供体上剪切下来,形成双链DNA断裂,然后将这些末端插入到目标位点中。TnsC非特异的结合DNA,在ATP存在下,会协助TnsA和TnsB完成剪切和插入过程。TnsD和TnsE的功能主要是来寻找插入的靶位点,单纯的TnsABC是不能完成重组过程的。
 
DH10Bac菌株: DH10Bac菌株,也就是pFastBac载体的宿主菌,包含有一个是杆状病毒穿梭质粒Bacmid(具有 Kanr),含有 mini-attTn7 靶位点,该位点插入的位置具有一段编码 LacZα 肽的 DNA 序列。DH10Bac还含有一个辅助质粒(pMON7124 (13.2 kb)。辅助质粒含有 tnsABCD区(辅助质粒表达转座酶),具有四环素抗性。
 
Bac-to-Bac系统介导的
 
腺相关病毒的生产
 
一般来说,Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达可以分为以下几个步骤:
 
1. 将目的基因克隆到pFastBac载体上。
 
2. 将上述质粒转化DH10Bac菌株中,制备重组Bacmid。
 
3. 将重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒。
 
4. 扩增杆状病毒,测定重组杆状病毒滴度。
 
5. 按照一定的MOI值感染Sf9细胞进行腺相关病毒的包装,测定滴度及活性。
 
 
图片来源:https://www.sohu.com/picture/429205257
 
当构建好的重组 pFBD 载体转化 DH10Bac时,由辅助质粒提供转座酶,转座就会发生于 pFastBacTMDual 的 mini-Tn7 元件与 Bacmid 的 mini-attTn7  靶位点之间,将目的基因表达框引入到 Bacmid 中,同时破坏了 LacZα 肽的表达,通过抗性选择和蓝白斑筛选即可以得到含有目的基因表达框的重组 Bacmid,重组 Bacmid转染 Sf9 细胞就可以包装出重组杆状病毒。也就是P1代病毒(滴度低,只能做初步小试实验)。然后将P1代病毒,再次感染昆虫细胞,进行病毒扩增,形成P2代病毒(滴度高)。测定得到的重组杆状病毒的滴度,并按一定的MOI值进一步感染Sf9细胞,即可得到腺相关病毒。
 
昆虫Sf9细胞生产AAV的优势
 
1. Sf9昆虫细胞可以在大型生物反应器中以高密度的悬浮细胞方式培养,因此用其生产AAV,对比传统利用哺乳动物细胞制备AAV的方法更有效、生产上更易放大规模。
 
2. 杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的,并且不能在昆虫细胞外复制,对比质粒转染、Ad-AAV、HSV-AAV等扩增方式残留的辅助病毒组分更加安全。因此,使用昆虫细胞株的生产环境仅需要较低的生物安全等级。
 
3. 昆虫细胞的培养使用的是无血清培养基,排除了任何动物源成分,进一步强化了该载体系统的生物安全性。
 
结语:
 
通过杆状病毒表达系统生产重组AAV可以实现大规模的生产,但生成重组AAV需要多个步骤,包括克隆目的基因至杆状病毒转移载体、从转移载体制备重组杆粒、杆粒转染并使用杆状病毒转导昆虫细胞等,这些步骤相对于传统的三质粒转染法生产AAV具有更高的技术复杂性、花费时间也更长,该系统仍然存在挑战。
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