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高通量筛选——基于生化水平和细胞水平的方法
2021-11-20
开发一种新药的过程可能是漫长、复杂和不确定的,但从社会、科学和经济的角度来看,它也可能是高回报的。高通量筛选(HTS)已经成为药物发现的主要工具。今天,向大家介绍目前用于靶标确认的几种HTS方法,主要分为两大类:生化水平和细胞水平。生化水平分析包括比率荧光法(FA/FP)、荧光共振能量转移(FRET)、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)等;细胞水平的分析包括细胞活力、报告基因、第二信使和高内涵成像等。
 
基于生化水平的实验
生化筛选利用纯化的目标蛋白,在体外测定配体的结合或酶活性的抑制。这些检测通常在384孔板中以竞争的形式进行,其中所研究的化合物必须取代已知的配体或底物。荧光法由于其使用简便、灵敏度高和灵活性强等特点,广受科研人员的欢迎,主要有比率荧光法(FA/FP)、荧光共振能量转移(FRET)、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)。
 
1. 比率荧光法(FA/FP)
一种广泛应用的HTS技术是荧光各向异性(FA)/荧光偏振光(FP)。FA和FP方法实际上通过测量了染料所经历的旋转相关时间或翻滚时间的变化来表征分子量。在这些技术中,用偏振光激发荧光团,并用平行或垂直于入射光偏振的偏振器测量荧光发射。随着时间的推移,染料标记的分子下降,发射信号去极化。与大分子结合降低了荧光团的迁移率,从而增加了极化或各向异性,并允许定量结合。根据所涉及的质量,选择染料的寿命以最大化结合后的信号变化。荧光素和罗丹明等有机染料的寿命约为3-4ns,它们在连接到分子量在0.5-10kDa范围内的生物分子时最为敏感。
图1 荧光偏振(FP)和各向异性(FA)的定义
(Blay, V., et al., Drug Discovery Today.2020)
 
2. 荧光共振能量转移(FRET)
荧光共振能量转移(FRET)是指在两个不同的荧光基团中,如果一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠,当这两个荧光基团间的距离合适时,就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象,即以前一种基团的激发波长激发时,可观察到后一个基团发射的荧光。常见的供体-受体对之间的有效距离通常为2-6nm,适用于许多蛋白质相互作用。染料通常是有机分子,如与蛋白质偶联的荧光素和罗丹明,或与感兴趣的蛋白质融合的荧光蛋白。
图2 基于 FRET 的荧光测定原理
(Potekhina, E. S., et al., International Journal of Molecular Sciences, 2020)

3. 时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)原理为具有长寿命荧光(通常为100秒的毫秒至毫秒)的镧系配合物用作FRET供体,荧光蛋白或有机荧光团(例如,别藻蓝素或Cy5)用作受体。普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期为毫秒级,有6个数量级的差别。所以在检测时,TR-FRET有一个时间延迟~100微秒,从而使反应体系内普通背景荧光信号消耗掉,因此TR-FRET的背景信号非常低,能够反映样品实际情况。
图3 TR-FRET检测示意图
(Zhang, F., et al., Acta Pharmacologica Sinica. 2019)
 
基于细胞水平的实验
基于细胞水平的筛选的关键特征之一是可以一次筛选多个靶标。基于细胞的筛选常用于以下情况下:1)所需的分子靶标未知,2)靶标无法在生化测定中充分重组,3)所需的表型只存在于细胞环境中,例如从一种细胞类型分化到另一种细胞类型。基于细胞的检测贯穿于药物发现的所有阶段:靶标选择和验证、初步筛选、先导化合物识别、先导化合物优化以及安全和毒理学筛选。介绍一些细胞水平分析的方法:细胞活力、报告基因、第二信使和高内涵成像等。
1. 细胞活力测定
细胞活力的测定常用于药物筛选。一种常见且可靠的活力测定为使用荧光素酶催化底物(荧光素)氧化,在ATP依赖性反应中产生发光来测量ATP含量。我们也常使用如钌、阿拉马尔蓝和四氮唑类化合物(MTT、MTS、XTT和WST-1)等染料通过测定荧光或颜色的变化来测定细胞活力。此外,细胞活力也可以通过细胞内酶(蛋白酶、LDH)在培养基中的释放或通过将不透膜的荧光染料插入DNA(如碘化丙啶)来评估,也可以使用膜渗透性DNA染料对细胞进行计数。
 
图4 荧光素酶介导的荧光素发光原理
(Yao, Z., et al., Journal of the American Chemical Society. 2020)

2. 报告基因实验
在报告基因检测(也称为信号通路检测)中,报告蛋白的序列编码是在相关通路的转录控制下引入的。通过荧光或光学读数监测报告基因的表达,通过这些指标来间接反应启动子的激活或抑制程度。观察到的信号是整个通路的产物,筛选的化合物可以在该通路上的任何点相互作用。常见的报告基因是CAT(氯霉素乙酰转移酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、LAC(β-内酰胺酶)、LUC(荧光素酶)和GFP。我们通常使用的为LUC(荧光素酶),但也可以使用其他报告基因。
图5 报告基因检测方法
(Blay, V., et al., Drug Discovery Today.2020)
 
3. 第二信使
第二信使分析检测通路内信使分子的表达或转运,提供比报告基因分析更接近的反应。这些方法被广泛应用于GPCR药物筛选。如果靶标激活细胞内Ca2+,则可以使用钙敏染料(如Fluo-3、Fluo-4、钙绿或基于水母发光蛋白的发光)直接测定其活性。如果GPCR不能自然调节细胞内Ca2+水平,则可以对其进行改造以使用混杂或嵌合G蛋白刺激Ca2+信号传导。
图6 GPCR信号转导机制
(Dhyani, V., et al., Cellular Signalling, 2020)
 
4. 蛋白质片段互补分析
蛋白质片段互补分析(PCA,也称为双分子荧光互补)和双杂交筛选允许检测细胞中蛋白质相互作用的形成/抑制。PCA将单个检测蛋白(荧光素酶、GFP、GAL)分成两部分,这些部分与感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用融合;如果伴侣结合,检测蛋白会重新形成并检测到信号。
5. 高内涵成像
高内涵成像平台(HCS)由于其能够提供出色的单细胞分析功能和最短的数据采集时间获得大家的青睐。一般的实验流程为设计实验并使用自动分液仪将细胞接种到96、384或1536孔板中;然后加入化合物,由于细胞在孵育过程中会对化合物做出反应,随后对细胞进行染色,并通过HCS成像系统获取图像,最后通过软件分析获取的图像以确定化合物的剂量反应。
图7 高内涵筛选流程
(Blay, V., et al., Drug Discovery Today.2020)
 
HTS通常是药物发现工作的开始,HCS在一定程度上加速了药物筛选的进程 。镁伽鲲鹏实验室引进了多种多功能酶标仪及高内涵成像系统,可以对活细胞或复杂的3D模型进行监测,检测化合物对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响,在细胞水平全面评价化合物的成药可能性。
 
参阅文献
1.Blay, V., Tolani, B., Ho, S. P., & Arkin, M. R. (2020). High-Throughput Screening: today’s biochemical and cell-based approaches. Drug Discovery Today.
2.Potekhina,E.S.,Bass,D.Y.,Kelmanson,I.V.,Fetisova,E.S.,Ivanenko,A.V.,Belousov,V.V.,&Bilan,D.S.(2020).Drug Screening with Genetically Encoded Fluorescent Sensors: Today and Tomorrow. International Journal of Molecular Sciences,22(1),148.
3.Zhang,F.,Sun,Z.,Liao,L.,Zuo,Y.,Zhang,D.,Wang,J.,…Luo,C.(2019).Discovery of novel CBP bromodomain inhibitors through TR-FRET-based high-throughput screening. Acta Pharmacologica Sinica.
4.Yao,Z.,Zhang,B.S.,Steinhardt,R.C.,Mills,J.H.,&Prescher,J.A.(2020).Multicomponent Bioluminescence Imaging with a π-Extended Luciferin. Journal of the American Chemical Society.
5.Dhyani,V.,Gare,S.,Gupta,R.K.,Swain,S.,Venkatesh,K.V.,&Giri,L.(2020).GPCR mediated control of calcium dynamics: A systems perspective. Cellular Signalling,109717.
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