内毒素相信大家都不陌生，在实验过程中，它总是会给我们带来意外，那大家有没有具体了解过它呢？这里给大家具体的介绍一下内毒素。
概述
一般细菌毒素包括外毒素和内毒素，外毒素是多数革兰阳性菌和少数革兰阴性菌在生长过程中释放到体外的一种蛋白质性物质。具有抗原性强、毒性强、特异性强的特点，具有明显的宿主细胞亲和性。另一类为内毒素（Endotoxin），是革兰氏阴性菌（GNB）的细胞壁的产物。只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。除了脂多糖外，其它的内毒素还有：芽孢杆菌属的苏云金杆菌的德尔它内毒素，对人无毒，但对某些昆虫有毒。
尽管内毒素作为GNB 的细胞壁组分，但在极少数真菌（Fungi）、立克次氏体（Rickettsia ）、支原体（Mycoplasma ）、螺旋体（Spirochaeta ）、衣原体（Chlamydia ）等微生物以及某些动植物组织中亦可见到内毒素。因而内毒素在自然界中分布广泛，从空气、水到土壤等环境中，无处不在。
图片来源：Su W , Ding X . Methods of Endotoxin Detection[J]. Journal of Laboratory Automation, 2015, 20(4):354-64.
内毒素的危害
脂多糖与DNA或蛋白质的结合非常牢固，容易被共同纯化。制备质粒DNA和重组蛋白时，细菌破壁之后释放的大量脂多糖无论是离子交换、凝胶排阻过滤等一般程序还是氯化铯超速离心等高级制备程序都无法去除干净。脂多糖具有强烈的免疫活性和细胞毒性并产生复杂的细胞生物学效应，因此大多数情况下会明显干扰并产生不可预测的实验结果，如在DNA转染实验中，内毒素竞争性干扰转染试剂与DNA的结合，无论是对原代、传代细胞还是整体动物均具有显著的毒性作用，显著降低转染效率并降低外源基因表达水平。
图片来源：https://max.book118.com/html/2021/0428/5110300013003224.shtm
当人(或动物)体血液系统的输入液中混入微量的细菌内毒素时,可激活组织内的炎性细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎症反应，在很短时间内将会使人产生昏迷和高烧，若不及时抢救，很可能危及生命。
内毒素的性质
1.性质稳定
具有耐热性，即便常规高压灭菌法（如高压灭菌）也不能将内毒素彻底清除。试验表明，需在160 ℃加热2 h以上才能将其彻底灭活。
2. 作用无特异性
内毒素致病症状与病理变化大致相同，如发热、白细胞增多、腹泻等。
3. 致热性
内毒素作用于人体细胞，使之释放内源性热原，再作用于体温调节中枢，引起发热反应。
内毒素致热的机理
内毒素可作用于单核细胞与巨噬细胞（如肺泡巨噬细胞、脾巨噬细胞、肝星状细胞、腹腔巨噬细胞等）以及某些肿瘤细胞等，使其产生IL-1、TNF-α、干扰素（IFN）、巨噬细胞炎症蛋白-1（MIP-1）、白细胞致热源（LP）以及睫状体促神经因子（CNTF）等内源性致热因子，即内源性致热源（Endogenous pyrogen, EP），内生致热源直接作用于神经中枢敏感神经元。当这些因子在机体内过量时，则可导致机体出现发热、低血压、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。
图片来源：Ciesielska A , Matyjek M , Kwiatkowska K . TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling[J]. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 2020:1-29.
检测方法
目前FDA已经批准了以下LAL检测法：凝胶法（ToxinSensorTM凝胶法内毒素检测试剂盒）、浊度法和显色法（ToxinSensorTM显色法LAL内毒素检测试剂盒）。
1. 半定量测定——凝胶法
通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来半定量内毒素的方法，是各国药典细菌内毒素检查的首选方法。
2. 定量测定——浊度法和显色法
浊度法（动态浊度法和终点浊度法）是通过鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来测定内毒素含量的方法。终点浊度法是基于细菌内毒素浓度和反应混合物的终点浊度( 吸收度或透光率) 之间的定量关系的一种检测方法；动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色法（动态显色法和终点显色法）是将鲎试剂与内毒素反应，可使特定底物显色，通过释放出的呈色团的多少来测定内毒素含量，又称为比色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间, 或检测色度增长速度的方法。
内毒素检测方法的选择
1. 凝胶法——仅需检测样品的内毒素限量。此法操作比较简单、经济，不需要专用测定设备，可进行定性或半定量测定。
2. 显色法（或浊度法）——定量测定样品中内毒素含量。
日常检测量不大时，可以选择终点显色法，用普通的分光光度计就可完成实验。
检测的样品是生物制品、疫苗、血液制品等最好选用终点显色法或动态显色法。
检测量比较大，检测的样品对鲎试剂的干扰不大，可选用动态浊度法。
注：动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
图片来源：http://www.gxghsw.com/wsw/25981.html
清除法
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方法
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原理
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优点
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缺点
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液相分离法
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一些去污剂，如Triton X-114，脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法萃取内毒素从而使后者有效地去除
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对内毒素的去除率高，且不影响有效成份的活性。该法简单高效、价格低廉、适合大规模应用，在日常的蛋白纯化中较为常用
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去内毒素后的样品会有微量去污剂的残留
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分子筛法
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分子筛是利用凝胶的网状结构，根据分子大小进行分离的一种方法。由于蛋白质和内毒素的分子量有较大差别，因此利用分子筛可以有效去除内毒素
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去除效果明显
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每次处理量小，处理时间较长
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离子交换色谱法
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当溶液pH＞2时，内毒素带有负电荷。因此内毒素与阴离子交换介质Q或DEAE Sepharose Fast Flow有较强结合。柱上的内毒素可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除
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成本低，吸附容量大
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但不适合于溶液中存在其它带负电荷物质的情况
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亲和色谱法
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将适当的配基固载于色谱基质上合成出亲和介质，使它特异性结合内毒素。GenScript将多粘菌素B（PMB）偶联于Sepharose FF 上，以此介质特异性吸附内毒素
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高效能、高选择性
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相对成本较高
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超滤法
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由于内毒素具有较大的相对分子质量，因此可选用超滤膜去除溶液中的内毒素
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操作简单，处理量大
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操作过程中的压力较高。不适合含有较大相对分子质量成份的样品。因为在除去热原的同时会阻留或吸附样品中的有效成份，使产品收率大受影响
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吸附法
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活性炭用于去除内毒素是由于内毒素的相对分子质量较大。适合于组分较为简单的小分子的溶液中或水中去除内毒素。活性炭常用量为0.1%～0.5%
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成本低，处理量大。
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活性炭的选择性较差，易吸附有效成份，纯化后溶液中的残余活性炭不易去除，且自身可能含有的重金属造成样品污染，因此目前很少使用
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上述去内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用。比如，如果液相分离法得到的蛋白内毒素水平未达标，可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。目前市面上的内毒素检测试剂盒是通过鲎试剂的特性去定性或定量检测内毒素。因细菌内毒素耐热性及化学稳定性强，所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活。目前行之有效的方法，多采用亲和色谱、超滤法或者清除剂的方法。
大家是不是对内毒素有了更深的了解了呢？本期内毒素的内容就为大家介绍到这了。
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