免疫荧光（Immunofluorescence）：又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种，根据抗原抗体的特异性结合检测样品中的某种蛋白的方法。
以抗原与抗体反应结合为基础，联合荧光色素标记，对细胞或组织内特定物质进行标记或示踪的一种实验方法。在细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
1. 固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞，一般再4%甲醛室温固定15min，1×PBS洗涤3次，每次5min。

2. 通透：使用交联剂固定后的细胞，一般需要再加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证能够达到抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透时间一般在5-15min。通透后1×PBS洗涤3次，每次5min。

通常情况下是先固定后通透，但是如果所检测的抗原是水不溶性的蛋白的话，可以先通透再固定，这样可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。

3. 封闭：使用封闭液对细胞进行封闭，室温封闭30min-1h。

一抗结合：吸走封闭液，加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜。1×PBS洗涤3次，每次5min。

4. 二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。1×PBS洗涤3次，每次5min。

5. 封片及检测：按需求进行核/浆复染，封片，荧光显微镜观察。
1. 信号微弱或没有信号

一般遇到这种情况，可能是实验操作问题，包括实验操作不当、样本保存不当、固定不足、抗体用量不合适、一抗孵育时间不合适、错误的通透方法、二抗使用不当、错误的激发波长等；还有可能是蛋白表达问题，目的蛋白需要诱导表达或者表达量低。

2. 高背景

对于染色过深，遇到这种情况需要我们做的是优化实验条件，可能是由于封闭不充分、抗体使用浓度过高、抗体孵育时间过长或者孵育温度过高、样本变干、清洗不足、非特异性结合抗体等。

总而言之，要想免疫荧光实验结果尽如人意，首先必须要做好实验前的准备，了解蛋白详细信息；接着在实验阶段选择合适的固定剂和通透剂；最后抗体孵育时需摸索出合适的抗体浓度和孵育时间。

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